Это ядро любого эксперимента по редактированию генома. Сегодня чаще всего используются готовые системы на основе Cas9 или Cas12a (Cpf1).
Фермент Cas (нуклеаза):
Cas9: Наиболее распространенный вариант. Требует наличия гидовой РНК (gRNA).
Варианты доставки:
Плазмидная ДНК: Кодирует белок Cas9 и gRNA. Самый дешевый, но менее эффективный метод.
мРНК Cas9: Синтетическая мРНК, кодирующая белок Cas9. Более высокая эффективность и скорость действия, меньше побочных эффектов, чем у плазмид.
Рибонуклеопротеиновый комплекс (RNP): Готовый комплекс очищенного белка Cas9 и синтетической gRNA. Золотой стандарт для большинства экспериментов.Обеспечивает最高шую эффективность, специфичность и минимальный офф-таргет эффект. Рекомендуется для работы с первичными и труднotransфекцируемыми клетками.
Гидовая РНК (gRNA / sgRNA):
Определяет специфичность системы. Это короткая РНК-последовательность, комплементарная целевой ДНК.
Варианты доставки:
Плазмидная ДНК: Кодирует последовательность для gRNA (требует экспрессии внутри клетки).
Синтетическая gRNA: Готовая к использованию РНК. Предпочтительный вариант при использовании с RNP-комплексом или мРНК Cas9. Обеспечивает быстрое действие и отсутствие нежелательной экспрессии.
Донорная матрица (для HDR-редактирования):
Если ваша цель — не просто разрыв ДНК (knockout), а точечное исправление или вставка гена (knock-in), необходим донорный матрикс (ODN — одноцепочечный олигонуклеотид или плазмида с гомологичными плечами). Он служит «заплаткой» для точного внесения изменений клеточными системами репарации (HDR-путем).
Культуральная лаборатория: Полный набор для работы с клеточными культурами.
Ламинарный бокс (II класса биобезопасности).
CO₂-инкубатор.
Центрифуга для микропроберок и пробирок.
Анализатор клеток (или микроскоп с камерой для подсчета).
Химические реагенты: среды, PBS, трипсин, антибиотики, сыворотка.
Пластик: чашки, планшеты, пипетки, наконечники, пробирки.
Оборудование для доставки компонентов (трансфекции/трансдукции):
Электроporator: Наиболее универсальный и эффективный метод доставки, особенно для RNP-комплексов и трудных клеточных линий.
Реагенты для химической трансфекции (липофекция): Подходят для многих стандартных клеточных линий (например, HEK293, HeLa). Существуют коммерческие коктейли, оптимизированные specifically для доставки RNP-комплексов.
Вирусные векторы (лентивирусы, AAV): Используются для доставки CRISPR-компонентов in vivo или в труднотрансфицируемые клетки. Требуют работы в лаборатории с соответствующим уровнем биобезопасности.
Оборудование для анализа результатов:
ПЦР-амплификатор: Необходим для амплификации целевого локуса.
Электрофорезная система (капиллярная или гелевая): Для первичного анализа эффективности редактирования (например, с помощью T7E1 или Surveyor assays).
Секвенатор: Обязателен для подтверждения редактирования. Sanger-секвенирование ПЦР-продуктов с последующим анализом хроматограмм (например, в программе ICE Synthego) или NGS для глубокого анализа и проверки на офф-таргет эффекты.
Дизайн gRNA: Критически важный этап. Необходимо использовать специализированные онлайн-инструменты для подбора специфичных и эффективных гидов с минимальным офф-таргет потенциалом.
CRISPRscan.org (для работы in vivo)
Benchling (интегрированная платформа для дизайна и анализа)
Инструменты от Broad Institute (GPP Portal)
CRISPRpick, ChopChop
Анализ данных секвенирования:
TIDE (Tracking of Indels by Decomposition) / ICE (Inference of CRISPR Edits): Веб-инструменты для анализа хроматограмм Sanger-секвенирования и расчета эффективности редактирования.
Программы для анализа данных NGS (CRISPResso, Cas-Analyzer).
Контроль эффективности доставки: Использование флуоресцентно-меченых синтетических gRNA для отслеживания трансфекции под микроскопом или проточным цитофлуориметром.
Оценка эффективности редактирования:
Первичный скрининг: T7E1/Surveyor assay, ПЦР с анализом длины ампликонов.
Подтверждение: Клонирование ПЦР-продуктов и секвенирование колоний или прямое секвенирование ПЦР-продуктов (Sanger, NGS).
Проверка на офф-таргет эффекты: Анализ in silico (прогнозирование с помощью ПО) и экспериментальная валидация наиболее вероятных офф-таргет сайтов с помощью ПЦР и секвенирования или методом GUIDE-seq.
